|
|
Studium proteinu oligandrinu sekretovaného oomycetou Pythium oligandrum
Neykulova, Anastasia ; Bělonožníková, Kateřina (vedoucí práce) ; Adámková, Lyubina (oponent)
Oomyceta Pythium oligandrum působí jako mykoparazit patogenních hub, bakterií i oomycet v půdě díky produkci řady hydrolytických enzymů pro degradaci polysacharidů i proteinů v buněčné stěně hostitele. Zároveň také P. oligandrum dokáže interagovat s kořeny rostlin prostřednictvím specifických elicitorů a stimulovat obranyschopnost a růst rostlin. P. oligandrum je tedy úspěšně používaným ekologicky šetrným prostředkem biologické ochrany rostlin. Mezi sekretované elicitory P. oligandrum patří nízkomolekulární proteiny oligandriny (~10 kDa), které mají charakteristickou strukturu a konzervovanou sekvenci mezi skupinou tzv. elicitinů, a současně nejsou homologní k rostlinným proteinům. V rámci této bakalářské práce byla analyzována produkce oligandrinu v různých typech pěstebních médií po kultivaci P. oligandrum. V kultivačních médiích byla také sledována celková proteolytická aktivita a obsah fenolických látek jako dalších možných elicitorů obranných reakcí rostlin. Dále se tato práce soustředila na možnost rekombinantní exprese oligandrinu v buňkách E. coli a jeho následnou purifikaci. Klíčová slova: Pythium oligandrum, oligandrin, elicitory, kultivace, rekombinantní exprese
|
|
|
Příprava růstového faktoru TGF-β3 s coiled-coil kotvou
Otépka, Tomáš ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Růstové faktory představují skupinu významných látek metabolismu organismů. Jedná se o signální molekuly, které kontrolují aktivitu buňky na endokrinní, parakrinní nebo autokrinní úrovni. Jsou klíčovým prostředníkem vázajícím se na receptory buňky, čímž spouští kaskádu reakcí vedoucí k regulaci genetické transkripce v jádře buňky a stimulaci buněčné odpovědi. Růstové faktory ovlivňují řadu fyziologických funkcí jako buněčnou proliferaci, diferenciaci a hojení tkání. Využití růstových faktorů se nabízí například v regenerativní medicíně. Za obdobným účelem byla zahájena výzkumná práce na přípravu růstového faktoru TGF-β3 s možným připojením na polymerní nosič pomocí coiled-coil kotvy. Tato práce se zabývá rekombinantní produkcí TGF-β3, resp. jeho obdoby spojené s peptidem asociovaným s latencí (LAP) a aplikací některé z technik, která by byla využitelná pro záměr této práce, tedy k připojení proteinu k polymernímu nosiči na bázi aminokyselin. Vzhledem ke strukturní komplexitě, se kterou se růstové faktory fyziologicky z buněk uvolňují, příprava růstových faktorů s coiled-coil kotvou in vitro představuje na poli rekombinantní exprese proteinů neprobádanou výzvu. V našem expresním systému buněčné linie HEK293T bylo možné připravit latentní formu LAP-TGF-β3, pro niž byla ověřena biologická aktivita na...
|
|
|
Strukturní a funkční charakterizace inhibice koronavirové methyltransferázy.
Ivanovská, Dana ; Bouřa, Evžen (vedoucí práce) ; Faltová, Lenka (oponent)
Koronavirové methyltransferasy se účastní modifikace 5'-konce virové RNA. Svou enzymatickou aktivitou zajištují nejen účinnou translaci virových proteinů, ale také maskují vlastní RNA před imunitním systémem hostitele. Tato práce se zaměřuje na methyltransferasy SARS-CoV-2 (methyltransferasová doména nestrukturního proteinu 14, MT14 a nestrukturní protein 16 spolu s jeho kofaktorem - nestrukturní protein 10, nsp16/10), které představují atraktivní cíle pro terapeutický zásah. Cílem této práce byla strukturní charakterizace koronavirových methyltransferas v komplexu s různými malými molekulami. Rekombinantně připravené proteiny byly purifikovány a následně podrobeny krystalizačním experimentům. Získané krystaly heterodimeru nsp16/10 v komplexu se sinefunginem byly namáčeny do roztoku obsahujícího nukleotidový analog S-adenosyl-L-homocysteinu. Optimalizací identifikovaných primárních krystalizačních podmínek MT14 s dvěma různými inhibitory byly získány krystaly vhodné pro měření jejich difrakce a následnou strukturní analýzu. Získaná strukturní data budou sloužit jako podklad pro návrh nových inhibitorů cílících na S-adenosyl- L-methionin vazebné místo nsp14. Klíčová slova: methyltransferasa, nsp14, nsp16, koronavirus, SARS-CoV-2, rekombinantní exprese, krystalizace proteinů
|
|
|
Produkce cysteinových katepsinů a strukturní charakterizace jejich interakce s peptidomimetickými inhibitory
Wichterle, Filip ; Mareš, Michael (vedoucí práce) ; Knejzlík, Zdeněk (oponent)
Cysteinové katepsiny se účastní řady patologických procesů jako jsou nádorová, neurodegene- rativní, kardiovaskulární nebo autoimunitní onemocnění. Tato práce se zaměřuje na katepsin B, L a V (CatB, CatL, CatV), které jsou atraktivními cílovými molekulami pro vývoj inhibitorů jako potenciálních chemoterapeutik a diagnostických nástrojů. Cílem práce bylo připravit uve- dené katepsiny a strukturně charakterizovat jejich komplexy s vybranými syntetickými pepti- domimetickými inhibitory. CatB a CatL byly rekombinantně připraveny v kvasinkách Pichia pastoris a podmínky exprese byly optimalizovány pro přípravu proenzymových forem. Pro CatB a CatL byl navržen chromatografický purifikační protokol a CatV byl purifikován na zá- kladě již známého protokolu. Získané enzymy byly použity k přípravě komplexů se šesti pep- tidomimetickými inhibitory vybavenými karbamátovou, vinylsulfonovou nebo azanitrilovou reaktivní skupinou, které selektivně inhibují CatB, CatL, resp. CatV. Byly určeny jejich inhi- biční parametry v kinetickém testu a identifikovány počáteční krystalizační podmínky. Po op- timalizaci krystalizačních podmínek pro CatB se třemi karbamátovými inhibitory byly získány krystaly vhodné pro rentgenostrukturní analýzu. Na základě krystalových struktur těchto kom- plexů byl analyzován vazebný mód...
|
|
|
Rekombinantní příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1 pro studium jeho interakcí s DNA
Kúdelová, Veronika ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Proteiny TEAD patří do významné rodiny transkripčních faktorů, které se během vývoje organismu podílí na regulaci jeho růstu a diferenciace buněk prostřednictvím aktivace exprese nejrůznějších genů. Tato rodina sdílí dvě vysoce konzervovaná místa, a to TEA DNA vazebnou doménu, po které tyto proteiny získaly název, a doménu, pomocí níž transkripční faktory váží další koaktivátory. Protože TEAD proteiny nejsou samy o sobě schopné transkripce, interagují s řadou koaktivátorů, které umožňují regulovat transkripci požadovaného genu. Poruchou regulace aktivity TEAD proteinů může docházet ke vzniku nádorových onemocnění. Proto v dnešní době hrají proteiny rodiny TEAD nemalou roli při vývoji nových protinádorových léčiv. Jedním ze způsobů inhibice těchto proteinů je zabránění jejich vazbě na DNA, tedy blokace aktivního místa v DNA vazebné doméně. Tato bakalářská práce se zabývá rekombinantní expresí zmíněné DNA vazebné domény transkripčního faktoru TEAD1, která je prodloužená o aminokyseliny v nestrukturované oblasti. Po nalezení vhodných podmínek produkce bylo přistoupeno k produkci ve velkém objemu následované purifikací a ověřením identity proteinu. Nakonec byla potvrzena schopnost interakce produkovaného proteinu s DNA. Připravený protein bude tedy možné využít ke studiu způsobů jeho interakce s DNA,...
|
|
|
Příprava a využití kyselých proteáz pro štěpení proteinů v experimentech H/D výměny.
Kukla, Jan ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pompach, Petr (oponent)
- 4 - Abstrakt Vodík/deuteriová výměna ve spojení s hmotnostní spektrometrií (HX-MS) využívá spontánní výměny amidických vodíků proteinové páteře za atomy deuteria z roztoku k získání informace o změnách v proteinové struktuře. Pro lokalizaci těchto změn na konkrétní oblasti proteinu je nejčastěji využívána enzymatická digesce zkoumaných proteinů aspartátovými proteasami. Schopnost proteas produkovat malé překrývající se peptidy, které dostatečně pokrývají celou proteinovou sekvenci, je zásadní pro lokalizaci konkrétních oblastí, které nás v proteinu zajímají. V této práci byly připraveny rekombinantní proteasy nepenthesin I (z Nepenthes gracilis) a rhizopuspepsin (z Rrizopus chinensis) a byly srovnány s komerčně dostupnými proteasami prasečím pepsinem A a aspergillopepsinem (z Aspergillus saitoi). Porovnání bylo provedeno aktivitními testy, kdy byl zkoumán vliv pH, teploty a denaturačních a redukčních činidel na stabilitu a ktivitu proteas v roztoku. Všechny čtyři proteasy byly imobilizovány na polymerní nosič POROS a jejich aktivita v online HX-MS uspořádání byla testována štěpením myoglobinu jako modelového substrátu.
|
|
|
Rekombinantní příprava transkripčního faktoru TEAD1.
Řeháková, Jana ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Bláha, Jan (oponent)
TEAD1 je jedním ze zástupců rodiny transkripčních faktorů TEAD. Tento transkripční faktor je velmi důležitý např. pro vývoj orgánů. Struktura celého transkripčního faktoru TEAD1 ještě není známa. Je známa struktura TEA vazebné domény, která je důležitá pro vazbu transkripčního faktoru TEAD1 na DNA, a transaktivační domény, na kterou se váží koaktivátory. TEAD1 se váže na DNA a po navázání koaktivátoru působí na transkripci různých genů. Mezi geny, které jsou ovlivňované transkripčním faktorem TEAD1, patří geny řídící buněk. TEAD1 je také posledním článkem Hippo signalizační dráhy, která je v dospělosti aktivní a zabraňuje zvýšenému růstu orgánů. Důležité pro aktivitu transkripčního faktoru TEAD1 jsou posttranslační modifikace, jako je Pro zjištění celé struktury transkripčního faktoru TEAD1 a způsobu, jakým interaguje byl v této práci rekombinantně připraven transkripční faktor TEAD1 expresí buňkách bak . Byly nalezeny vhodné podmínky produkce transkripčního faktoru TEAD1. Rovněž bylo provedeno štěpení histidinové kotvy thrombinem a nakonec byl připravený protein izolován a purifikován.
|
|
|
Rekombinantní příprava proteinu RhoA s afinitní sondou.
Filipová, Barbora ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Počet střevních infekcí spojených s užíváním antibiotik u lidí rapidně roste. Virulentní toxiny C. difficile, Yersinií a mnoha dalších bakterií cílí na protein RhoA. Jedná se o GTPasu, která je součástí signálních buněčných drah a její hlavní funkcí je regulace aktinového cytoskeletu. Zmíněné toxiny činí tento protein nefunkčním, což může vést až k fatální destrukci buňky. V dnešní době je diagnostika popsaných infekcí nedostačující. Využití proteinových čipů a hmotnostní spektrometrie k určení modifikace proteinu RhoA se jeví jako možný způsob stanovení těchto střevních bakteriálních onemocnění. A proto je cílem této práce rekombinantně připravit kýžený protein RhoA s navázanou afinitní sondou, která bude sloužit k jeho imobilizaci na biočip. Takto připravený protein bude dále využit v diagnostice popsaných onemocnění.
|
|
|
Příprava a studium lidského lymfocytárního receptoru LLT1
Bláha, Jan ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Přirozené zabíječské buňky (NK buňky) jsou pro svojí schopnost rozpoznat a přivodit buněčnou smrt nádorovým a virem infikovaným buňkám bez předchozí antigenní senzitizace intenzivně studovanou součástí imunitního systému. Jejich imunitní funkce je regulována signály vyvolanými interakcí povrchových stimulačních a inhibičních receptorů s ligandy přítomnými na cílové buňce. Současný výzkum receptorů NK buněk C-lektinového typu ukázal, že jejich ligandy se nacházejí v rámci stejné proteinové rodiny, popisující tak receptor-ligandovou interakci dvou lektinů. Je tomu tak i v případě inhibičního receptoru lidských NK buněk NKRP1 (gen KLRB1) a jeho ligandu LLT1 (gen CLEC2D). Imunologické studie popisují ochranu nádorových buněk před imunitním systémem zvýšenou expresí receptoru LLT1 nádorovými buňkami nebo sníženou expresí receptoru NKRP1 na NK buňkách. Tato diplomová práce popisuje úspěšnou produkci rozpustné formy LLT1 metodou rekombinantní exprese v lidských embryonálních ledvinných buňkách (HEK 293). Ukazuje, že lichý počet cysteinů obsažených v rámci extracelulární lektinové domény LLT1 způsobuje agregaci a špatné sbalení proteinu. Rozpustná forma LLT1 byla stabilizována obnovením šestého cysteinu v evolučně konzervované pozici přístupem cílené mutageneze. Tvorba třetího disulfidického můstku byla...
|
|
|
Structure and function of C-type lectin NK cell receptors studied by recombinant expression and protein crystallography
Vaněk, Ondřej ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze 2010 Struktura a funkce C-lektinových receptorů NK buněk studovaná pomocí rekombinantní exprese a proteinové krystalografie Abstrakt dizertační práce Ondřej Vaněk Školitel: Prof. RNDr. Karel Bezouška, DSc. NK buňky (přirození zabíječi) byly popsány pro jejich schopnost spontánně zabíjet určité allogenní nádorové linie, a to bez jakékoliv předchozí senzitizace. NK buňky jsou součástí neadaptivní imunitní odpovědi s velmi krátkou reakční dobou vůči patogenům, jakými jsou například viry, intracelulární bakterie a parazité. Jsou také zodpovědné za eliminaci některých rakovinných buněk a mohou tak bránit rozvoji nádorové transformace a bojovat proti rozšiřování metastáz. Aktivita NK buněk je regulována pomocí rovnováhy mezi aktivačními a inhibičními signály zprostředkovanými povrchovými receptory NK buněk. Ze strukturního hlediska může být většina NK buněčných povrchových receptorů klasifikována jako C- lektinové nebo imunoglobulinové receptory. Jednou z mnoha podskupin C-lektinů jsou i lymfocytární receptory II. typu, které jsou exprimovány na NK buňkách. Předkládaná práce měla dva hlavní cíle. Prvním bylo nalezení vhodných expresních a purifikačních systémů pro vybrané C-lektinové receptory NK buněk a druhým pak provést jejich biochemickou a...
|
host ::
RSS.